現代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但

是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認識和了解。

1、正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團，如胺基團

(NH2,APS)和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。

由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團的極性較強，因此，分離的次序是依據樣品

中的各組份的極性大小，即極性強弱的組份*先被沖洗出色譜柱。

正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿

（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene  Chloride）等。

2、反相色譜

反相色譜填料常是以硅膠為基礎，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。

反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。

樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合*先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有

更強的保留。

常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。

二、聚合物填料

聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優點是在PH值為1～

14均可使用。

相對與硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白

質等樣品的分離非常有效。

現在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。

三、其他無機填料

其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化。由于其特殊的性質，一般**于特殊的

用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基

鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基

鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用于分離某些幾何導構體，又由

于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，

氧化鋁微粒剛性強，可制成穩定的色譜柱柱床，其優點是可在PH高達12的流動相中使用。

但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應用，

新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應

用PH范圍1～14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實驗難

度，其重要用途與優勢尚在進行中。

怎樣選擇填料粒度

目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、

5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，填

充柱的柱效越高；小于3um的填料應用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，

但不是**的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料

是很有用的，3um填料填充柱的柱數比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，

3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更

短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使

用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

一、如何保證良好的柱性能與柱壽命

◆ 認證閱讀色譜柱使用說明書；

◆ 使用填充良好的色譜柱；

◆ 盡量減少壓力波動，避免機械及熱沖擊；

◆ 使用保護柱及在線過濾器；

◆ 經常以強溶劑沖洗色譜柱；

◆ 充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質微粒與強保留成分；

◆ 用穩定的固定相（C18*穩定）；

◆ 在中等PH值操作（6~8），用有機緩沖溶液；

◆ 色譜柱使用溫度*好小于40℃；

◆ 硅膠基質的的色譜柱，應保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0；

◆ 在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；

◆ 流動相中含有緩沖溶液，應注意應95∶5的水及有機溶劑過渡，有機溶劑不能低于5%；

◆ 過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機溶劑流動相保存（乙晴*好）。

HPLC固定相及應用范圍

名稱    別名      功能基團   正相  反相  離子對  應用
 
Silica                     -OH           √                         非極性和中等極性以及非離子性有機化合物。
 
SAS   C1             -(CH3)3               √                在所有的烷基鍵合相中對非極性化合物保留*

                                       弱，典型用于中等極性和多官能團化合物.
 
Butyl  C4              -C4H9                 √    √       分離肽和蛋白質，保留時間比C8和C18短。
 
MOS  C8，         -C8H17                 √     √      中等極性相中對中等化合物，小肽和蛋白質，

          Octyl                                                           極**族化合物和環境樣品。
 
ODS  C18            -C18H37              √     √       烷基鍵合相中對中等極性化合物保留*強。廣

                                       泛用于**，甾族化合物，脂肪酸和環境樣品.
 
CPS   CN ,Cyano  -(CH2)3CN      √    √          對極性化合物有獨特的選擇性，適合應用于正相

(propyl                                                       分離，當用于反相系統時，其選擇性與  C8和

Nitrile)                                                       C18不同，在藥學領域和復雜混合物的分離中應

                                用廣泛。
 
APS  NH2            -(CH2)3 NH2     √    √         反相中分析糖類和其他極性化合物。弱陰離子交

         (AminoPropyl)                                              換 ，陰離子和有機酸則應用緩沖劑和有機改性

                                       劑 做流動相。正相中與硅膠的選擇性機改性劑

                                       不同,分析芳香族效果很好。
 
Phenyl                    -(CH3)C6H5             √     √  芳香族化合物
 
Diol                        -(CH2)2O      √     √      反相時，分離肽和蛋白質。正相時，與硅選擇

                              CH2(CH2OH)2                                性 相似,但極性較弱。
 
SCX  強陽離子    -(CH2)2C6H4SO3H-            √  有機堿

交換
 
SAX  強陰離子     -(CH2)3N+(CH3)3　　　　　　 有機酸，核苷和核苷酸

交換